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蛋白印跡儀

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湖南高中电梯视频 蛋白質印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

蛋白印跡儀

免疫印跡法實驗原理和目的

免疫印跡(immunoblotting)又叫做蛋白質印跡(Western blotting),是通過抗原抗體的特異性結合來對復雜樣品中的某種蛋白進行檢測的方法。此方法是一種新的免疫生化技術。

免疫印跡法 (Western blotting) 是一種結合了免疫化學分析和技術高分辨率凝膠電泳的雜交技術。免疫印跡法是對蛋白質特性、表達與分布進行檢測最常用的一種方法,例如病毒的抗體或抗原檢測、多肽分子的質量測定與組織抗原的定性定量檢測。免疫印跡法具有很強的特異性,很高的敏感度以及很大的分析容量。免疫印跡法(immunoblotting test,IBT)也叫做酶聯免疫電轉移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITB),由于其類似于Southern早先建立的檢測核酸的印跡方法 Southern blot ,因此也被叫做Western-blot。


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電轉移方法

一般需要利用電泳方法將經電泳分離后的蛋白轉移到固相載體上,這個過程被叫做電泳印跡。以下為常用的兩種電轉移方法。

1.半干法:

用緩沖溶液浸濕的濾紙將凝膠和固相載體夾在中間,通電10-30min。


2.濕法:

在轉移緩沖溶液中浸放凝膠和固相載體夾心,由45min延長到過夜為轉移時間。

因為濕法有更大的使用彈性而且沒有對更多的時間和原料產生明顯地浪費,所以這里僅對濕法的基本操作過程進行描述。

需要采用可以識別一抗的第二抗體來識別目的蛋白,往往將購買的成品,即是如辣根過氧化物酶般已經被結合或標記了特定的試劑作為抗體。利用辣根過氧化物酶所催化的一個比色反應,即是這種標記,該反應的產物在固相載體上固定以及有特定的顏色,鑒別非常容易。所以能夠根據識別二抗來對一抗進行識別,從而使目標蛋白所在的位置被判斷出來。堿性磷酸酶系統和125I標記系統均屬于其他的識別系統。


實驗原理

蛋白質印跡法又叫做免疫印跡法,這是一種

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免疫印跡法操作步驟

免疫印跡法就是將蛋白質往膜上轉移,之后利用抗體進行檢測。能夠使用相應抗體作為一抗對已知表達蛋白進行檢測,能夠通過融合部分的抗體對新基因的表達產物進行檢測。


操作步驟

一、獲取蛋白質樣品:

細菌誘導表達后,能夠通過電泳上樣緩沖液將細胞直接裂解,將勻漿緩沖液加在真核細胞上,機械或超聲波室溫勻漿0.5-1分鐘。之后4攝氏度下13,000g離心15分鐘,取上清液作為樣品。


二、電泳:

對電泳凝膠進行制備,進行SDS-PAGE。


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三轉移:(半干式轉移)

1、完成電泳后將膠條切成合適大小,使用轉膜緩沖液平衡,分別進行3次,每次5分鐘。

2、膜處理:將與膠條同樣大小的濾紙和NC膜預先裁好,將其在轉膜緩沖液中浸沒10分鐘。

3、轉膜:轉膜裝置按照從下至上的順序依次將陽極碳板、24層濾紙、NC膜、凝膠、24層濾紙、陰極碳板放好,精確對齊濾紙、凝膠、NC膜,每一步均將氣泡去除,將500g重物壓上,吸干碳板上多余的液體。將電源接通,恒流1mA/cm2,轉移1.5hr。完成轉移后,將電源斷開,取出膜,對待測膜條割取來做免疫印跡。在膜染色液中放入有蛋白標準的條帶染色50秒之后,在50%甲醇中多次脫色,至背景清晰,然后用雙蒸水洗,風干,保存在兩層濾紙之間,和顯色結果對比。


四免疫反應:

1、洗膜使用0.01M PBS進行清洗,每次5分鐘,一共3次。

2.將包被液加入加入,室溫下保持2小時。

3.將包被液棄掉,洗膜使用0.01M PBS進行清洗,每次5分鐘,一共3次。

4.將一抗加入(用0.01M PBS根據合適稀釋比例進行稀釋,膜必須全部為液體所覆蓋),在4攝氏度下放置超過12小時,陰性對照,一抗使用1%BSA替代,其余步驟和實驗組一樣。

5.將1%BSA和一抗棄掉。膜使用0.01M PBS分別進行清洗,每次5分鐘,一共4次。

6、將辣根過氧化物酶偶聯的二抗加入(用0.01M PBS根據合適稀釋比例進行稀釋),平穩搖動,室溫下保持兩

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蛋白質印跡優點、原理和步驟

免疫印跡(immunoblotting)又叫做蛋白質印跡(Western blotting),是通過抗原抗體的特異性結合來對復雜樣品中的某種蛋白進行檢測的方法。此方法是一種新的免疫生化技術,其是基于凝膠電泳和固相免疫測定技術發展出來的。如今免疫印跡已經成為蛋白分析的一種常規技術,因為其既具備固相免疫測定的高特異性和敏感性,又具備SDS-PAGE 的高分辨力。某種蛋白的鑒定一般使用免疫印跡,并且可以定性和半定量分析蛋白。和化學發光相結合進行檢測,能夠同時對多個樣品同種蛋白的表達量差異進行比較。


優點

免疫印跡法是一項對抗原、抗體進行分析的技術。其具備如下優點。


1.孵育、洗滌的時間減短非常明顯。


2.為了用于多種分析和鑒定,能夠同時制作多個拷貝。


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3.以圖譜形式顯示結果,能夠長期保存結果。


4.免疫探針能夠利用將PH值降低等方法抹掉探針,用第二探針替換來進行進行分析檢測。


5.濕的固定化基質膜柔韌,操作簡單便捷。


6.固定化的生物大分子能夠均一地接近各種免疫探針,孔徑不會對其起阻隔作用。


7.免疫印跡分析所需的試劑量較少。


基本原理

在凝膠板上單向或雙向電泳分離混合抗原樣品,之后取固定化基質膜與凝膠相貼。凝膠中的單一抗原組在印跡紙的自然吸附力、電場力或其它外力作用下往印跡紙上轉移并且固相化,最后應用如免疫同位素探針或免疫酶探針等免疫覆蓋液技術檢測和分析抗原固定化基質膜。


基本步驟

抗原分離、抗原印跡和抗原檢定為免疫印跡法( 以抗原分析為例)的三個基本步驟。因為每一步采用不同的實驗方法,能夠使多種免疫印跡分析系統構成。


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免疫印跡法臨床應用

免疫印跡法是往膜上轉移蛋白質,然后利用抗體進行檢測。可通過融合部分的抗體對新基因的表達產物進行檢測,可用相應抗體作為一抗對已知表達蛋白進行檢測。其有很強的特異性,很高的敏感度,以及很大的分析容量。在對于蛋白質特性、表達與分布的檢測方面最為常用。例如病毒的抗體或抗原檢測、多肽分子的質量測定以及組織抗原的定性定量檢測。


相關疾病

巨細胞病毒感染癥

免疫反應

進行性肌營養不良癥

胃潰瘍

泌尿生殖系真菌病


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格斯特曼綜合征

小兒喘息樣支氣管炎

小兒幽門螺桿菌感染

肺出血-腎炎綜合征

丁型病毒性肝炎


相關癥狀

腸粘膜有壞死潰瘍

潰瘍

幽門前區潰瘍


臨床意義

需要檢查人群:檢查某種蛋白。異常結果:有特殊顯色反應,證明有某種蛋白質存在。


注意事項

不適宜人群:無 

檢查時禁忌:無 

1、不同的蛋白要經過預實驗來確定一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度的最佳條件。

2、使用時必須新鮮配置顯色液,最后將H2O2加入。

3、DAB有潛在可能致癌,要小心仔細地操作。


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免疫印跡法原理、試劑準備和注意事項

免疫印跡法就是將蛋白質往膜上轉移,之后利用抗體進行檢測。能夠使用相應抗體作為一抗對已知表達蛋白進行檢測,能夠通過融合部分的抗體對新基因的表達產物進行檢測。


原理

Western Blot類似于Southern或Northern雜交方法,然而其采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,用標記的二抗來“顯色”,抗體為“探針”,蛋白質為被檢測物。經過PAGE分離的蛋白質樣品往固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上轉移,固相載體以非共價鍵形式來進行蛋白質的吸附,并且可以使其生物學活性和電泳分離的多肽類型保持不變。抗原使用固相載體上的蛋白質或多,和對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過放射自顯影或者底物顯色來對電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分進行檢測。該技術也在蛋白水平的表達的檢測方面得到廣泛地應用。


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試劑準備

1、0.01M PBS(pH7.4):

Na2HPO4 1.44g;

KH2PO4 0.24g;

NaCl 8.0g;

KCl 0.2g;

加ddH2O至1000ml。


2、膜染色液:

乙酸2ml;

ddH2O118 ml;

包被液(5%脫脂奶粉,現配):脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中。

考馬斯亮蘭 0.2g;

甲醇80ml。


3、顯色液:

硫酸鎳胺 0.1ml;

H202 1.0μl;

DAB 6.0mg;

0.01M PBS 10.0ml。


4、SDS-PAGE試劑:見電泳實驗。


5、勻漿緩沖液:

10%SDS 6.0ml;

1.0M Tris-HCl(pH 6.8);

1.OmlddH2O 2.8ml;

β-巰基乙醇 0.2ml。


6、轉膜緩沖液:

SDS 0.37g;

甲醇200ml;

甘氨酸 2.9g;

Tris 5.8g;

加ddH2O定容至1000ml。


注意事項

1、DAB有潛在可能致癌,要小心仔細地操作。


2、使用時必須新鮮配置顯色液,最后將H2O2加入。


3、不同的蛋白要經過預實驗來確定一抗、二

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免疫印跡主要試劑

Western免疫印跡(WesternBlot)是往膜上轉移蛋白質,然后利用抗體進行檢測。可通過融合部分的抗體對新基因的表達產物進行檢測。可用相應抗體作為一抗對已知表達蛋白進行檢測。


主要試劑

1、5%(w/v)脫脂奶粉。


2、在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中溶解NaN30.02%疊氮鈉(有毒,戴手套操作)。


3、Tris緩沖鹽溶液(TBS):


NaCl 500mmol/L,Tris/HCL(pH7.5)20mmol/L。


4、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。


5、過氧化物酶標記的第二抗體。


6、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺,75mg/ml)。


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7、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺,50mg/ml)。


8、Tris-HCL(pH9.5)100mmol/L。


9、NaCl100mmol/L。


10、EDTA5mmol/L,Tris-HCL(pH7.5)50mmol/L。


11、丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺:

含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亞甲雙丙烯酰胺儲存液的配制應當使用溫熱(對溶解雙丙稀酰胺有利)的去離子水。取1gN,N-亞甲叉雙丙稀酰胺,29g丙稀酰胺,將水加入到100毫升。將其在棕色瓶中,4℃避光保存。由于堿催化或者光催化會發生脫氨基反應,因此必須確保PH不高于7.0。如果出現沉淀,可以過濾,若使用期超過兩個月,就必須重新配制。


12.十二烷基硫酸鈉SDS溶液:

10%(w/v)0.1gSDS使用1mlH2O去離子水配制,在室溫下保存。


13、分離膠緩沖液:

48ml 1mol/LHCL和1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8): 18.15g Tris混合,加水稀釋,使終體積到100ml,過濾后在40攝氏度下保存。


14、濃縮膠緩沖液:

在40ml H2O中溶解0.5mmol/L Tris-HCL(pH6.8):6.05g Tri

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